Transformation of the filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna: Electroporation versus Natural Transformation

Der Großteil der aktuellen, auf Kohlenstoff basierenden Waren wird entweder aus pflanzlichen Rohstoffen oder aus Erdöl gewonnen. Die damit verbundene Nachfrage nach Ressourcen steigt auf Grund der wachsenden Erdbevölkerung und den allgemeinen Bestrebungen zur Verbesserung des Lebensstandards. Im Gegensatz dazu sind die Verfügbarkeit von Agrarflächen und fossilen Energiereserven begrenzt. Außerdem wird der Anstieg von CO2 in der Atmosphäre seit dem Beginn der industriellen Revolution im 19. Jahrhundert als Hauptbeitrag des Menschen zur globalen Erwärmung angesehen. Es gibt einige Strategien um die Abhängigkeit von fossilen Kohlenstoffquellen zu reduzieren, wie etwa die Entwicklung von regenerativen Energien oder erhöhte Energieeffizienz. Der Einsatz von Cyanobakterien in der Biotechnologie ist eine weitere Strategie, die das Potential besitzt Landwirtschaft und Erdölindustrie als Quelle für kohlenstoffbasierte Produkte zu ersetzen. Produkte, die sich von Cyanobakterien oder Pflanzen ableiten, führen nicht zur Erhöhung des CO2 Gehalts in der Atmosphäre. Im Vergleich zu Landpflanzen ist die Kultivierung von Cyanobakterien nicht abhängig von fruchtbarem Land und viele Arten der Cyanobakterien weisen höhere Wachstumsraten als Pflanzen auf. Außerdem sind einige Cyanobakterien genetisch manipulierbar, wodurch die Synthese natürlicher Produkte verstärkt werden kann oder die rekombinante Produktion von neuen Stoffen möglich ist. Die mögliche Produktpalette reicht von preiswerten Verbindungen, wie Biokraftstoffen, bis hin zu hochwertigen Produkten, wie pharmazeutischen Wirkstoffen. Auch wenn es im Bereich der rekombinanten Biotechnologie mit Cyanobakterien schon kommerzielle Anwendung gibt, befindet sich das gesamte Feld dennoch in seinen Kinderschuhen. Während im Bereich der metabolischen Optimierung, der molekularen Werkzeuge und der Bioreaktorentwicklung in den letzten Jahren und Jahrzehnten deutliche Fortschritte gemacht wurden, ist die Etablierung von neuen Organismen nach wie vor eine Herausforderung. Die Forschung konzentriert sich größtenteils auf wenige, leicht transformierbare Modelorganismen der Ordnungen Synechococcales und Nostocales, da die Etablierung von Transformationsprotokollen für neue Stämme und Arten oft eine Herausforderung darstellt. Allerdings wird die rekombinante Biotechnologie mit Cyanobakterien ohne ein breites Spektrum an nutzbaren Stämmen möglicherweise hinter ihrem Potential zurück bleiben, da vorteilhafte Eigenschaften von vielversprechenden Kandidaten nicht genutzt werden können. Diese Arbeit setzt sich mit der beschriebenen Limitierung auseinander, indem ein verlässliches und effizientes Transformationsprotokoll für Phormidium lacuna etabliert wurde. Diese Art wurde kürzlich von unserer Arbeitsgruppe als vielversprechend für die cyanobakterielle Biotechnologie charakterisiert. Da die Gattung Phormidium bislang noch nicht für genetische Manipulation zugänglich war, war es das Ziel dieser Arbeit ein Transformationsprotokoll zu entwickeln und das Potential für die Biotechnologie an Hand der rekombinanten Ethanolsynthese zu charakterisieren. Die rekombinante Produktion von Ethanol ist gut charakterisiert innerhalb der cyanobakteriellen Biotechnologie und ermöglicht den Vergleich mit anderen Cyanobakterien hinsichtlich Produktivität. VII Bei der Etablierung eines Protokolls zur Elektroporation wurde deutlich, dass Phormidium lacuna natürlich transformierbar ist. Natürliche Transformation ist bislang nur für wenige Stämme der Cyanobakterien beschrieben und dies ist der erste Bericht für die Ordnung Oscillatoriales. Natürliche Transformation erlaubt verlässlichen und effizienten Gentransfer mittels homologer Rekombination in Phormidium lacuna. Die Integration des Selektionsmarkers kanR ins Genom von Phormidium lacuna vermittelt eine deutliche Resistenz gegenüber Kanamycin (bis zu 14,3 mg/ml). Die kanR Sequenz verteilt sich sehr schnell in allen Genomkopien: Nach zwei Kulturzyklen nach der ersten Kultivierung der entsprechenden Transformanten war die kanR Sequenz in allen Genomkopien einer Zelle vorhanden. Phormidium lacuna Transformaten für die rekombinante Ethanolproduktion wurden generiert indem die codierenden Sequenzen für die Enzyme Pyruvatdecarboxylase und Alkoholdehydrogenase ins Genom integriert wurden. Die Ethanolproduktion wurde über die Ethanolkonzentration im Kulturüberstand mittels Gaschromatographie nachgewiesen. Allerdings konnte keine erhöhte Ethanolproduktion von Transformanten im Vergleich zum Wildtyp von Phormidium lacuna nachgewiesen werden. Mögliche Gründe hierfür und geeignete Schritte in Richtung einer biotechnologischen Anwendung von Phormidium lacuna wurden diskutiert. Der unerwartete Fund der natürlichen Transformation für Phormidium lacuna ist möglicherweise ein Hinweis darauf, dass die Fähigkeit zu natürlicher Transformation weiter unter den Cyanobakterien verbreitet ist, als bislang angenommen wurde. Um diese Fragestellung zu adressieren wurden der Fund der natürlichen Transformation in dieser Arbeit und die weiteren Beispiele, die in der Literatur beschrieben sind, mit den Cyanobakterien im Allgemeinen verglichen. Basierend auf der Homologie zu Proteinen, die an der natürlichen Transformation beteiligt sind, wurden cyanobakterielle Stämme vorgeschlagen, die potentiell transformierbar sind. Der Fund der natürlichen Transformation in dieser Arbeit hat viele Implikationen. Erstens: Phormidium lacuna ist nun effizient natürlich transformierbar, was eine essentielle Voraussetzung für die weiteren Arbeitsschritte mit diesem Organismus in Bereich der rekombinanten Biotechnologie darstellt. Zweitens: Da Phormidium lacuna leicht transformierbar ist und homozygote Transformanten in kurzer Zeit generiert werden können, bietet sich dieses Bakterium als vielversprechender Modellorganismus der filamentösen Cyanobakterien ohne Heterocysten an. Drittens: Der Fund von natürlicher Transformation in einer neuen Ordnung der Cyanobakterien weiß vermutlich daraufhin, dass natürliche Kompetenz eine weit verbreitete Eigenschaft innerhalb der Cyanobakterien ist und dass möglicherweise deutlich mehr Stämme zugängliche für rekombinante Biotechnologie sind

Abstracts from the 8th International Conference on cGMP Generators, Effectors and Therapeutic Implications

This work was supported by a restricted research grant of Bayer AG

Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna.

Research for biotechnological applications of cyanobacteria focuses on synthetic pathways and bioreactor design, while little effort is devoted to introduce new, promising organisms in the field. Applications are most often based on recombinant work, and the establishment of transformation can be a risky, time-consuming procedure. In this work we demonstrate the natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna and insertion of a selection marker into the genome by homologous recombination. This is the first example for natural transformation filamentous non-heterocystous cyanobacterium. We found that Phormidium lacuna is polyploid, each cell has about 20-90 chromosomes. Transformed filaments were resistant against up to 14 mg/ml of kanamycin. Formerly, natural transformation in cyanobacteria has been considered a rare and exclusive feature of a few unicellular species. Our finding suggests that natural competence is more distributed among cyanobacteria than previously thought. This is supported by bioinformatic analyses which show that all protein factors for natural transformation are present in the majority of the analyzed cyanobacteria

Role of natural transformation in the evolution of small cryptic plasmids in Synechocystis sp. PCC 6803

Small cryptic plasmids have no clear effect on the host fitness and their functional repertoire remains obscure. The naturally competent cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 harbours several small cryptic plasmids; whether their evolution with this species is supported by horizontal transfer remains understudied. Here, we show that the small cryptic plasmid DNA is transferred in the population exclusively by natural transformation, where the transfer frequency of plasmid‐encoded genes is similar to that of chromosome‐encoded genes. Establishing a system to follow gene transfer, we compared the transfer frequency of genes encoded in cryptic plasmids pCA2.4 (2378 bp) and pCB2.4 (2345 bp) within and between populations of two Synechocystis sp. PCC 6803 labtypes (termed Kiel and Sevilla). Our results reveal that plasmid gene transfer frequency depends on the recipient labtype. Furthermore, gene transfer via whole plasmid uptake in the Sevilla labtype ranged among the lowest detected transfer rates in our experiments. Our study indicates that horizontal DNA transfer via natural transformation is frequent in the evolution of small cryptic plasmids that reside in naturally competent organisms. Furthermore, we suggest that the contribution of natural transformation to cryptic plasmid persistence in Synechocystis is limited

The JOREK non-linear extended MHD code and applications to large-scale instabilities and their control in magnetically confined fusion plasmas

International audienceJOREK is a massively parallel fully implicit non-linear extended magneto-hydrodynamic(MHD) code for realistic tokamak X-point plasmas. It has become a widely used versatile simulation code for studying large-scale plasma instabilities and their control and is continuously developed in an international community with strong involvements in the European fusion research programme and ITER organization. This article gives a comprehensive overview of the physics models implemented, numerical methods applied for solving the equations and physics studies performed with the code. A dedicated section highlights some of the verification work done for the code. A hierarchy of different physics models is available including a free boundary and resistive wall extension and hybridkinetic-fluid models. The code allows for flux-surface aligned iso-parametric finite element grids in single and double X-point plasmas which can be extended to the true physical walls and uses a robust fully implicit time stepping. Particular focus is laid on plasma edge and scrape-off layer (SOL) physics as well as disruption related phenomena. Among the key results obtained with JOREK regarding plasma edge and SOL, are deep insights into the dynamics of edge localized modes (ELMs), ELM cycles, and ELM control by resonant magnetic perturbations, pellet injection, as well as by vertical magnetic kicks. Also ELM free regimes, detachment physics, the generation and transport of impurities during an ELM, and electrostatic turbulence in the pedestal region are investigated. Regarding disruptions, the focus is on the dynamics of the thermal quench (TQ) and current quench triggered by massive gas injection and shattered pellet injection, runaway electron (RE) dynamics as well as the RE interaction with MHD modes, and vertical displacement events. Also the seeding and suppression of tearing modes (TMs), the dynamics of naturally occurring TQs triggered by locked modes, and radiative collapses are being studied

Constitutive Activation of Gαs within Forebrain Neurons Causes Deficits in Sensorimotor Gating Because of PKA-Dependent Decreases in cAMP

Sensorimotor gating, the ability to automatically filter sensory information, is deficient in a number of psychiatric disorders, yet little is known of the biochemical mechanisms underlying this critical neural process. Previously, we reported that mice expressing a constitutively active isoform of the G-protein subunit Galphas (Galphas*) within forebrain neurons exhibit decreased gating, as measured by prepulse inhibition of acoustic startle (PPI). Here, to elucidate the biochemistry regulating sensorimotor gating and to identify novel therapeutic targets, we test the hypothesis that Galphas* causes PPI deficits via brain region-specific changes in cyclic AMP (cAMP) signaling. As predicted from its ability to stimulate adenylyl cyclase, we find here that Galphas* increases cAMP levels in the striatum. Suprisingly, however, Galphas* mice exhibit reduced cAMP levels in the cortex and hippocampus because of increased cAMP phosphodiesterase (cPDE) activity. It is this decrease in cAMP that appears to mediate the effect of Galphas* on PPI because Rp-cAMPS decreases PPI in C57BL/6J mice. Furthermore, the antipsychotic haloperidol increases both PPI and cAMP levels specifically in Galphas* mice and the cPDE inhibitor rolipram also rescues PPI deficits of Galphas* mice. Finally, to block potentially the pathway that leads to cPDE upregulation in Galphas* mice, we coexpressed the R(AB) transgene (a dominant-negative regulatory subunit of protein kinase A (PKA)), which fully rescues the reductions in PPI and cAMP caused by Galphas*. We conclude that expression of Galphas* within forebrain neurons causes PPI deficits because of a PKA-dependent decrease in cAMP and suggest that cAMP PDE inhibitors may exhibit antipsychotic-like therapeutic effects